“永新良圻”推荐阅读【猪群保健】猪细环病毒检测方法研究进展

导语：猪细环病毒（Torque teno sus virus，TTSuV）属于细环病毒科壬型细环病毒属成员，为无囊膜的单股负链环状DNA病毒。细环病毒（Torque teno virus，TTV）又称为输血传播病毒，是由日本学者Nishizawa等在1997年运用代表性差异分析（RDA）技术从一例输血后肝炎患者血清中首次发现的一种新病毒。TTV宿主范围非常广泛，包括灵长类动物中的人、黑猩猩和猴，家畜中的猪、牛、羊、犬、猫、鸡以及其他动物，如鼠和骆驼等。TTSuV是由美国学者Leary等于1999年利用巢式PCR（nPCR）从猪血清中首次检测到的。人源TTV至少可分为21个基因型，猪源TTSuV有2个基因型，分别为TTSuV1和TTSuV2，其核苷酸同源性仅为44%。不同年龄段的猪群均对TTSuV易感，我国猪群感染率大致在24%～100%。TTSuV传播途径广泛，可以通过粪-口传播、垂直传播、疫苗注射等途径进行传播。虽然TTSuV传播方式多样，临床阳性检出率也很高，但是目前还没有其单独导致猪致病的报道。迄今TTSuV的致病性尚不明确，目前研究只了解到其与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等病毒存在某种协同作用，当发生混合感染时会加重断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的症状，使病情加重，特别是对断奶仔猪造成严重危害，威胁着养猪业的发展，而且有潜在跨物种传播给人类的可能性，引起了养猪业的极大关注。

1.1 病毒的细胞培养

目前尚未找到合适的细胞系适于TTSuV的分离和培养，也没有合适的动物模型来研究该病毒。有很多学者已致力于病毒增殖的研究。Huang等构建TTSuV2感染性分子克隆转染传代系猪肾细胞（PK-15）、猪细胞（ST）和293T细胞后发现，TTSuV2在这些细胞中能够复制，但是复制水平很低。转染后，细胞连续传代20代后不能继续传代。

1.2  直接电镜观察

Yukio等通过免疫电镜首次观察到了人源TTV的球状病毒粒子形态，直径约为30～32 nm。刘建波等利用负染法在电镜下首次观测到了TTSuV1病毒粒子。

2.1 酶联免疫吸附试验

Huang等首次利用大肠杆菌（E.coli）原核表达了TTSuV2衣壳蛋白，建立了TTSuV2的蛋白质免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）血清学诊断方法，用于检测猪血清中TTSuV2抗体。张龙等成功制备了抗TTSuV1 Cap蛋白单克隆抗体，为TTSuV1检测方法的建立和抗原表位的鉴定奠定了基础。Jarosova等建立了间接ELISA方法对猪血清进行TTSuV两种基因型的检测，结果猪血清中TTSuV1和TTSuV2的阳性率分别为78%和88%。李淞建立了快速检测TTSuV2 ORF1抗体的间接阻断ELISA方法。为TTSuV2感染的有效监测提供了技术支持。刘建波、刘芊麟等先后以截短的TTSuV1 Cap融合蛋白为包被抗原，建立了检测TTSuV1抗体的间接ELISA方法。应用该法对北京、天津、河北3个地区规模化猪场的89份血清样本的检测结果显示，3地区的猪场的TTSuV1抗体阳性率为89.9%，表明我国京津冀地区部分猪场存在很高的TTSuV1感染率。张黎以纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立了检测TTSuV2的间接ELISA方法。运用该方法对采自江西3家规模化猪场的84份血清样品进行检测，阳性检出率分别为72%、57.5%、36.3%，表明江西规模化猪场存在较高TTSuV2感染率。

3.1  PCR

PCR是目前检测TTSuV最常用、有效的方法。国内外学者根据GenBank上登录的TTSuV基因组序列设计一系列引物，建立了诸多PCR检测方法，用于TTSuV的流行病学调查。Segalés等建立了检测TTSuV的PCR方法，对1985—2005年间的162份病料样品进行检测，结果TTSuV1阳性率为33.3%，TTSuV2阳性率为55.6%，TTSuV1和TTSuV2共感染率为23.5%。将TTSuV感染猪的时间可追溯到1985年，为TTSuV对动物的感染留下了最早的证据。翟少伦等用PCR方法检测了我国9个省市的191份血液样品和组织样品，结果TTSuV的总阳性率为77.0%，TTSuV1的单一阳性率为68.6%，TTSuV2的单一阳性率为53.9%，两种病毒的混合感染率为45.5%。随后对41份健康猪的血清样品进行检测，结果显示，TTSuV总阳性率、TTSuV1单一阳性率、TTSuV2单一阳性率及两种病毒的共感染率分别为43.9%、36.6%、24.4%和12.2%。在临床健康的猪体内存在该病毒，表明猪可能是TTSuV的储存宿主。娄高明等、王礞礞、南文金等分别建立了TTSuV1和TTSuV2的PCR方法，对采自华南地区的猪病料进行检测，表明在我国华南猪群中TTSuV的感染较为普遍。邹力应用建立的PCR检测方法对从四川部分地区所采集的254份血清样品进行检测，结果表明四川地区猪群中TTSuV感染普遍存在，且TTSuV2感染率更高，为整个西南地区猪TTSuV流行病学调查提供了数据支持。夏应菊等对我国29个省市猪场采集的1 898份猪血清样品同时进行PCV2和TTSuV的PCR检测，结果表明我国猪群中TTSuV和PCV2混合感染现象较为普遍。张志成等采用PCR对来自江苏地区6个猪场的398份血清样品进行TTSuV检测，结果表明TTSuV感染在江苏地区猪群中普遍存在，并对我国养猪产业构成潜在威胁。李海超等应用PCR方法对采自山东、福建、安徽、河北、河南、广西、辽宁和湖北八省份的227份样品进行PCV2、TTSuV1和TTSuV2的检测。结果表明上述省份的猪群中普遍存在PCV2和TTSuV的混合感染。张青占等采用PCR对2011—2012年期间从江苏、安徽、天津、湖北、上海、浙江6个省份共采集的无明显临床症状的猪血清488份和发病猪群样品352份进行检测。结果显示，在无明显临床症状的猪血清中，TTSuV1和TTSuV2感染率分别为41%和67%，二者混合感染率为28%。PMWS发病猪样品中PCV2阳性率高达75%，PCV2和TTSuV2的混合感染高达61%。在PRRSV为阳性的病料中，TTSuV2的阳性率高达86%。在初产母猪和流产胎儿中，TTSuV1和TTSuV2的感染率，以及与不同病毒的混合感染率均高于健康猪群的感染率。这些研究为猪源TTSuV提供了流行病学资料，也为研究混合感染的致病机理奠定了基础。

3.2  套式PCR

套式PCR又称巢式PCR（Nested PCR）。套式PCR反应过程中需要使用两对引物并经过两轮扩增，其敏感性和特异性均优于普通PCR。Mckeown等根据TTSuV非编码区设计一对套式PCR引物，对6个国家猪群中感染情况进行了检测，结果显示TTSuV阳性率为66.2%（102/154）。Martinez等用巢式PCR方法对欧洲野猪感染TTSuV检测，结果表明TTSuV1在欧洲野猪群中的流行率为58%、TTSuV2流行率为66%。Kekarainen等采用巢式PCR方法对猪血清和进行TTSuV检测，结果表明血清中TTSuV感染率为74%、中为72%，中TTSuV的高检出率显示TTSuV可能通过性途径传播。Pozzuto等采用巢式PCR对母猪和仔猪TTSuV感染情况进行检测，表明TTSuV可以垂直传播，胎儿感染率很高。王礞礞等用巢式PCR方法检测了广东、福建、江西等7个省的280份血液样品和组织样品，首次证实了我国猪群中存在TTSuV感染，且TTSuV1和TTSuV2的单一阳性检出率分别为37.6%和82.6%，混合阳性检出率为34.5%。洪绍锋等采用巢式PCR方法对广西不同猪场的95份血液样品和组织样品进行了TTSuV检测，结果显示，TTSuV1的阳性率为37.9%，TTSuV2的阳性率为20.0%，表明广西部分地区猪群确实存在TTSuV的感染。韦建兴等应用巢式PCR方法，对2009—2011年采自广西140个规模猪场的156份血液、流产胎儿及肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、淋巴结等组织样品进行检测，结果发现，广西猪群中TTSuV总感染率达到93.6%，TTSuV2的感染率（76.9%）明显高于TTSuV1（16.7%）。TTSuV多与PCV2和PRRSV混合感染。李坤等、田光玲先后根据TTSuV保守结构UTR序列设计引物建立了巢式PCR方法。应用该法对从江西南昌、宜春、赣州等8个地区不同猪场采集的183份血液样品进行检测。结果显示TTSuV1的感染率为40.4%，TTSuV2的感染率为68.9%，TTSuV1和TTSuV2混合感染率为30.1%。这些研究为我国开展TTSuV的流行病学调查及相关研究奠定了基础。

3.3  荧光定量PCR

鉴于普通PCR和套式PCR只能从定性方面来检测TTSuV，而不能从量的方面来确定病毒的载量，研究者建立了实时荧光定量PCR（QRT-PCR）方法用来检测TTSuV。Anddreas等根据TTSuV基因组在非编码区设计引物和探针建立探针法荧光定量PCR，对203份猪血清样品进行了TTSuV检测，结果显示，TTSuV1、TTSuV2单独感染率分别为32%和17%，二者混合感染率为32%。陈欣等根据TTSuV UTR保守区域分别设计了两对特异性引物，建立了SYBR Green I二重荧光定量PCR方法，最低检出量为10copies/mL。王俊等、单晶晶等先后建立了TTSuV1和TTSuV2 SYBR Green I实时定量PCR方法，用于TTSuV两型的检测和定量分析。

3.4  高效液相色谱法

DHPLC全称变性高效液相色谱分析。RCR反应扩增后结合DHPLC技术可同时分析数百个样品，且可省去琼脂糖电泳的步骤，更加省时简便。杨春华等建立了检测TTSuV1和TTSuV2的高效液相色谱法（PCR-DHPLC）技术，对从江西5个规模化猪场采集的80血清样品分别进行PCR-DHPLC、荧光PCR和PCR检测，结果显示PCR-DHPLC和荧光PCR阳性检出率相当，高于PCR法。应用PCR-DHPLC技术可对TTSuV感染猪进行早期、快速检测及病原流行病学调查和实时监测，同时也为研究TTSuV在猪体内的感染及分布提供了新的检测技术。

3.5  反向PCR

反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知核苷酸序列，Huang等首次利用反向PCR方法扩增出TTSuV全长序列，证明猪群中可能普遍存在不同亚型的TTSuV混合感染。

3.6  环介导等温扩增技术

向海洋等运用环介导等温扩增（LAMP）技术针对TTSuV1的UTR设计了LAMP引物，建立了TTSuV1的检测方法，检测灵敏度可达5.5 copies/μL。张黎也以TTSuV UTR和ORF1前端区域为靶序列，先后建立了检测TTSuV1和TTSuV2的LAMP方法。LAMP方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法，为TTSuV的早期快速诊断和流行病学监测提供了强有力的技术手段。

3.7  限制性片段长度多态性分析

限制性片段长度多态性分析（RFLP）技术是分子生物学重要分析方法的一种，用于检测DNA序列多态性。PCR-RFLP技术融合了PCR、RFLP分析和凝胶电泳方法，先通过PCR技术完成对靶序列的克隆，后续用不同限制性内切酶对PCR产物进行酶切，最后依据凝胶电泳结果而分型。Irshd等根据TTSuV2 ORF2中相对保守的区域设计了特异性引物，运用RFLP技术对印度猪群中TTSuV流行情况进行了调查。

综上所述，TTSuV和PCV2在猪群中共同感染广泛存在，传播途径广泛，危害性不容忽视，因此加强其流行病学和致病机理研究具有重要意义。自TTSuV发现以来，科研工作者进行了大量的流行病学研究，但由于病毒异质性强和共感染率高，很难得到单一基因型的纯培养物，而且病毒没有单一的嗜性靶器官，几乎所有组织脏器均有分布，这使得病毒分离非常困难，至今尚未建立起培养病毒合适的细胞系，这极大地限制了人们对TTSuV致病机制的深入研究。目前建立的血清学和分子生物学检测方法各有优缺点和实用性，临床上需要根据不同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方法。虽然上述检测方法为TTSuV的检测提供了有效的技术手段，但是随着人们对TTSuV的深入研究，相信检测技术将更加简便化、快速化和准确化，这必将对疾病的有效防控产品及技术的研制奠定基础。

本文选自《猪业科学》2016年第8期 “猪群保健”栏目中P99-101

（版权归《猪业科学》所有，如转载，请注明出处）

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